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不连续凝胶电泳色谱仪分析的不连续性表现

2022-06-24 来源:长乐市农业机械网

不连续凝胶电泳色谱仪分析的不连续性表现

不连续凝胶电泳色谱仪分析的不连续性表现在凝胶层、缓冲液离子组成、缓冲液pH和电位梯度的不连续。一、凝胶层的不连续性:1、样品胶:为大孔胶,采用光聚合法制备。样品预先加在其中,起防止对流的作用,避免样品跑到上面的缓冲液中。目前电泳一般不制作此胶。2、浓缩胶:为大孔胶,采用光聚合法制备。起防止对流的作用,样品在其中浓缩,并按其迁移率递减的顺序逐渐在其与分离胶的界面处浓缩成薄层。3、分离胶:为小孔胶,采用化学聚合法制备。样品在其中进行电泳和分子筛分离,起防止对流的作用。蛋白质分子在大孔凝胶中受到的阻力小,移动速度快。进入小孔凝胶时受到的阻力大,移动速度减慢。由于凝胶层的不连续性,在浓缩胶与分离胶的界面处使样品浓缩,区带变窄。二、缓冲液离子组成的不连续性:在电场中如有两种电荷符号相同的离子向同一方向移动,其迁移率不同,两种离子若能形成界面,则跑在前面的离子称为快离子(前导离子),跑在后面的离子称为慢离子(尾随离子)。为了使样品达到浓缩的目的,需在缓冲液中加入有效迁移率不同的两种离子,并使这两种离子在缓冲液中组成不连续的两相,即在三层凝胶中加入快离子,在电极缓冲液中加入慢离子。为了保持溶液的电中性和一定的pH值,需加入一种与快、慢离子电荷符号相反的离子,称为缓冲配对离子,使缓冲配对离子分布于全部缓冲液中,即三层凝胶缓冲液和电极缓冲液中。如分离蛋白质时,通常采用氯离子(Clˉ)为快离子,甘氨酸根离子((NH2CH2COOˉ)为慢离子,三羟甲基氨基甲烷(Tris+)为缓冲配对离子。电泳开始前,慢离子位于两个电极槽中,快离子分布于三层凝胶中,样品在样品胶中,缓冲配对离子分布于全部缓冲液中。电泳进行时,快离子与慢离子的界面向下移动。由于选择适当的pH值缓冲液,使蛋白质的有效迁移率介于快、慢离子之间,而浓缩成为极窄的区带。当样品到达浓缩胶与分离胶的界面处时,离子界面继续前进,蛋白质被留在后面,然后被分成多个区带。三、缓冲液pH的不连续性:在浓缩胶与分离胶之间有pH的不连续性是为了控制慢离子的解离度,从而控制其有效迁移率,要求在样品胶和浓缩胶中,慢离子比所有被分离样品的有效迁移率都低,使样品夹在快离子与慢离子的界面之间被浓缩。而在分离胶中,慢离子的有效迁移率比所有被分离样品的有效迁移率都高,使样品不再受离子界面的影响。电极缓冲液pH = 8.3,甘氨酸的电离小,有效迁移率小。浓缩胶中的氯离子完整电离,有效迁移率大。蛋白质在浓缩胶中介于快、慢离子之间。电泳开始后,氯离子跑得较快,留下一低电导区,产生高电位梯度,使甘氨酸根离子追赶氯离子,蛋白质夹在中间被压缩。四、电位梯度的不连续性:在不连续体系中,电位梯度的差异是自然形成的。电泳开始后,由于快离子的迁移率较大,会很快超过蛋白质,在快离子的后边形成一个离子浓度低的区域即低电导区。由于电导与电位梯度成反比,低电导区的电位梯度较高。高电位梯度使蛋白质和慢离子在快离子后面加速移动。当快离子、慢离子和蛋白质的有效迁移率与电位梯度的乘积分别相等时,则三种离子的移动速度相同。快、慢离子的移动速度相等的稳定状态建立后,在快、慢离子之间形成一个稳定而又不断向正极移动的界面,即在高、低电位梯度区之间形成一个迅速移动的界面,由于蛋白质的有效迁移率恰好介于快、慢离子之间,因此就聚焦在这个移动的界面附近,被浓缩成一个狭小的中间层。

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